研究内容

多酶级联反应能够通过多个酶的连续催化实现底物逐步转化，在底物通道、减少副产物和提高反应效率方面具有明显优势，但游离酶体系容易受到稳定性、酶间相容性以及中间产物传递效率等因素限制。金属有机框架（MOF）具有可调控的孔道和限域微环境，为多酶固定化和级联催化提供了新的材料平台。然而，传统的一锅法容易造成酶随机分布，而层层组装虽然能够构建核壳结构，却需要多步操作并分离中间产物。

针对这一问题，Fan等人在《Small》报道了一种顺序酶封装策略：在MOF形成过程中分阶段加入不同酶，使多种酶在同一个反应体系中依次形成核壳结构，无需在中间步骤分离产物。研究采用GOx-HRP作为双酶级联模型，并进一步拓展至具有相容性问题的Pro-ADH体系以及β-Gal/GOx/HRP三酶级联体系。作者还利用同步辐射太赫兹远红外（THz-Far-IR）光谱实时分析MOF形成过程，从而解析不同阶段的酶封装机制。

研究比较了三种封装策略：同时加入所有酶的一锅法、依次加入酶但不分离中间产物的顺序法，以及每一步均进行分离的层层组装法。其中，顺序法首先通过共沉淀形成含第一种酶的MOF核心，随后加入第二种酶，在较低MOF前驱体浓度下由酶促进生物矿化形成外层。THz-Far-IR结果进一步证明，第二阶段MOF的形成依赖第二种酶参与，说明无需移除第一阶段形成的MOF和剩余组分，即可继续完成核壳结构构建。

在GOx-HRP体系中，三种策略产生了明显不同的空间分布。一锅法中两种酶基本均匀混合，而顺序封装能够形成明显的核壳分层结构。GOx位于外层时，其对底物的可及性更高，GOx/HRP@ZIF-8-2的级联活性达到游离酶体系的93%，明显高于同时封装体系的25%；同时，其比表面积达到1919.55 m²/g，高于一锅法体系的1374.66 m²/g。研究认为，酶空间排列、较高表面积以及更有利的酶构象共同促进了级联催化效率。

更值得关注的是，该策略可以解决酶之间的相容性问题。在Pro-ADH体系中，蛋白酶Pro可能降解ADH，因此两种酶直接共存会影响催化性能。通过空间隔离后，Pro/ADH@ZIF-8-2的活性达到相同酶浓度游离体系的5.36倍，且连续使用10次后仍保持超过90%的初始活性。进一步将体系扩展至β-Gal/GOx/HRP三酶级联后，顺序封装体系的活性同样高于一锅法和分离式层层组装，并在60 ℃、DMSO及蛋白酶处理等条件下保持较高活性。

津合生物点评：

这项研究的核心并不是简单地将多种酶“装进MOF”，而是通过控制酶加入时序，将酶的空间位置转化为可设计的催化参数。研究证明，在多酶级联体系中，酶的位置、相互距离以及外部传质环境均可能直接决定整体催化效率，为MOF纳米生物杂化材料从“固定化载体”向“空间编程型生物反应器”发展提供了新的思路。

研究亮点：

亮点1：通过顺序封装实现多酶空间精准定位。
研究利用“先共沉淀形成核心、后生物矿化形成外壳”的方式，在无需中间分离的条件下构建MOF核壳结构，实现不同酶的分层定位，相比传统一锅法能够有效减少酶的随机分布。

亮点2：THz-Far-IR揭示了核壳结构的形成机制。
同步辐射THz-Far-IR光谱不仅用于表征最终材料，还用于追踪MOF在不同反应阶段的形成过程，从而证明第二阶段的MOF生长具有酶促进的生物矿化特征，为理解多酶封装过程提供了动态证据。

亮点3：空间排列显著改善多酶级联催化。
在GOx-HRP体系中，将GOx布置于外层可以提高底物可及性；顺序封装体系的级联活性达到游离酶的93%。更重要的是，在相互不兼容的Pro-ADH体系中，空间隔离使其活性达到游离酶的5.36倍，说明空间分隔能够同时解决酶活性与酶间兼容性问题。

亮点4：从双酶体系拓展至三酶级联并兼顾稳定性。
β-Gal/GOx/HRP三酶体系同样能够形成分层结构，顺序封装后的材料在高温、有机溶剂和蛋白酶环境下保持较高活性，并在连续10次循环后仍保留80%以上活性，体现出较好的工业生物催化应用潜力。

应用方向：

应用一：构建高效多酶级联生物反应器。
通过预先设计不同酶的空间位置，可以改善底物进入、反应中间体传递以及酶间距离，为复杂的多步生物催化反应构建更加高效的固定化反应平台。

应用二：解决工业酶催化中的酶间不相容问题。
对于蛋白酶与其他易被降解的酶、或者具有不同最适反应环境的酶，MOF核壳结构能够提供物理隔离，从而降低相互干扰，为药物中间体合成、代谢工程和生物制造提供新的酶组织方式。

应用三：用于复杂化学品与药物中间体合成。
研究指出，该策略具有应用于多糖及药物中间体生物合成的潜力，例如麦芽七糖、D-阿洛酮糖、莫努匹韦和青蒿素相关合成路线。通过多酶协同和空间分层，可进一步拓展连续生物催化工艺。

应用四：开发可循环使用的纳米生物催化材料。
MOF不仅能够提供酶的空间组织，还能提高其对高温、蛋白酶和有机溶剂的耐受性，并支持多次循环使用。因此，该体系有望进一步发展为具有高稳定性、可回收和可重复使用特征的工业纳米生物催化剂。