研究内容

传统多酶级联催化通过将多个酶串联，实现复杂反应的一步化和高效化，但不同酶之间的空间分布、比例匹配、底物进入以及中间体扩散往往难以精准控制。受细胞内生物分子凝聚体启发，研究团队提出了一种由带相反电荷的单酶纳米凝胶（SENs）自组装形成复合凝聚体的新策略，使酶不仅被集中固定，还能够构建具有特定物理化学性质的局部催化微环境，从而提高级联反应效率。

研究首先分别以葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）为核心，通过原位聚合在单个酶分子表面形成柔性聚丙烯酰胺水凝胶壳层。其中，GOx@SEN+引入季铵盐阳离子，HRP@SEN−引入羧酸阴离子，从而赋予两种纳米凝胶相反电荷。两种SEN混合后，通过静电作用及氢键等非共价相互作用发生液-液相分离，形成富集多种酶的微米级凝聚体（coacervates）。

研究发现，该体系具有较宽的环境适应范围。在pH 4.0–9.0范围内均能够发生凝聚，除柠檬酸盐体系因多价反离子破坏复合形成外，大多数缓冲体系均具有良好兼容性。进一步调节两种SEN的比例，可以控制凝聚体内部GOx与HRP的摩尔比，在实验范围内实现约0.5–1.5的可调控比例。优化条件下，凝聚体内部总蛋白浓度达到约0.4 mM，GOx和HRP相对于稀相分别实现约233倍和96倍富集，形成接近细胞质蛋白浓度的高密度催化环境。

这种凝聚体并不是简单的“酶聚集”。荧光分子分配实验显示，其内部具有轻微的正电微环境，能够优先富集带负电的小分子，同时小分子在凝聚体内部仍保持较高扩散速率。FRAP实验进一步证明，小分子能够快速进出凝聚体，而酶则相对稳定地被限制在内部。因此，该体系实现了“酶高浓度聚集、小分子自由交换”的特殊结构，为级联催化提供了理想的局部反应空间。

以GOx-HRP为模型级联反应，GOx首先利用葡萄糖生成H₂O₂，随后HRP利用原位产生的H₂O₂氧化ABTS。结果显示，凝聚体中的级联反应kcat比未形成凝聚体的SEN体系提高25%；当葡萄糖浓度低于1 mM时，初始反应速率最高可提高约3倍。研究认为，低底物浓度下主要得益于凝聚体对葡萄糖的局部富集，而高底物浓度下则更多依赖GOx产生的H₂O₂在局部环境中的积累，从而提高HRP的底物可及性。

研究进一步将该策略拓展至具有实际生物制造价值的烯还原酶（ERED）/葡萄糖脱氢酶（GDH）级联体系。其中ERED负责还原环己烯酮，GDH利用葡萄糖实现NADPH再生。通过调节SEN比例和离子强度，体系能够形成囊泡、纳米凝聚体、沉淀以及微米凝聚体等不同形态。最终，优化后的微米级凝聚体（MicroC）表现出约94%的底物转化率，明显高于纳米凝聚体的7%和囊泡体系的38%，证明凝聚体形貌、酶比例和内部微环境共同决定级联催化效率。

津合生物点评：

研究亮点：

亮点1：首次将“单酶纳米凝胶”与复合凝聚体结合

传统凝聚体通常依赖蛋白质、核酸或合成聚合物之间的相互作用，容易受到蛋白种类和环境条件限制。本研究利用SEN表面电荷工程人为赋予不同酶互补的界面性质，使原本难以发生凝聚的球状酶能够主动组装形成复合凝聚体。更重要的是，SEN本身就是催化单元，不需要额外加入惰性支架，因此兼具结构组装与催化功能。

亮点2：实现酶比例与催化微环境的双重调控

级联反应中不同酶的最佳比例往往并不相同。本研究通过调节SEN投料比例，可以直接控制凝聚相中的GOx∶HRP摩尔比；同时，离子强度又能够改变凝聚体的形貌和内部相互作用。因此，研究建立了“酶比例—相分离形态—局部微环境—催化效率”之间的调控关系，使多酶体系从简单共混进一步发展为可设计的催化微反应器。

亮点3：证明“酶浓度高”并不是提高级联效率的唯一因素

研究中不同凝聚形态的催化表现存在显著差异，尤其在ERED/GDH体系中，NanoC即使具有较高的ERED浓度，转化率仍只有7%，而MicroC达到94%。这说明级联催化性能并非简单取决于酶负载量，还受到小分子扩散、底物富集、中间体局部积累以及SEN比例等多因素共同影响。

亮点4：从模型反应拓展至药物合成相关酶体系

研究进一步引入具有生物合成和药物制造价值的ERED/GDH体系，验证该平台并非只能用于GOx-HRP模型反应。MicroC能够有效招募带负电的NADP(H)，同时维持较高的小分子扩散能力，为辅因子循环型级联反应创造了更加有利的局部环境，体现出该体系向实际生物催化和生物制造应用拓展的潜力。

应用方向：

应用一：多酶级联生物催化

该平台能够将不同酶高浓度共定位，同时调节酶比例和底物分配，因此可用于手性药物中间体、精细化学品及天然产物的多步酶法合成。相比传统游离酶共混，凝聚体能够缩短中间体扩散距离，并通过局部富集提高整体反应效率。

应用二：人工细胞与仿生代谢系统

凝聚体内部可以形成类似细胞质的高蛋白浓度，并对底物和中间体进行选择性富集，因而能够作为人工细胞中的无膜细胞器。未来可进一步组装三酶、四酶甚至更复杂的级联网络，模拟天然代谢通路，实现具有空间组织能力的人工代谢系统。

应用三：生物制造与辅因子循环

ERED/GDH体系已经证明该平台能够同时容纳目标酶与辅因子再生酶，并显著提高反应转化率。未来可将其用于NAD(P)H依赖型氧化还原酶体系，通过设计带电微环境主动富集辅因子，降低辅因子扩散损失，为高附加值药物和精细化学品的绿色合成提供新的催化平台。

应用四：智能化纳米酶反应器

SEN的表面化学具有高度可调性，未来可以进一步引入不同电荷、疏水基团或特异性结合基团，实现对底物、辅因子和中间体的选择性招募。结合微流控、连续流反应器及多级相分离技术，有望构建可动态调节组成和催化效率的智能生物催化体系。研究团队也指出，提高凝聚体的胶体稳定性和循环使用能力，将是推动该体系进一步应用的重要方向。